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對(duì)于ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)新手來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)中遇到的一些棘手的問(wèn)題便無(wú)從下手，天津本生小編列出了ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)中一些常見(jiàn)的問(wèn)題以及解決方法，希望對(duì)您有所幫助：
問(wèn)題序號(hào)可能原因解決方法顯色淡，靈敏度偏低
1 試劑盒未充分平衡試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開(kāi)盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫(約25℃)
2 樣品不適合做ELISA檢測(cè)樣品一般選擇培養(yǎng)上清、血清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測(cè)或者需要優(yōu)化檢測(cè)的條件(例如稀釋液的成分)
3 酶標(biāo)板在貯存或洗后拍干時(shí)過(guò)分干燥防止板過(guò)于干燥
4 包被抗體遭到破壞操作溫和，移液槍不能碰到孔底
5 樣本和抗體孵育條件不合適按照說(shuō)明書(shū)條件，建議孵育過(guò)程中全程振蕩孵育。
6 洗滌浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)按照說(shuō)明書(shū)操作。勿人為增加浸泡時(shí)間;
7 偶聯(lián)HRP試劑污染棄去試劑，重新配置
8 錯(cuò)誤的稀釋偶聯(lián)HRP試劑棄去試劑，重新配置
9 TMB底物孵育時(shí)間過(guò)短，因非人為因素影響，需要優(yōu)化孵育時(shí)間確定合適的孵育時(shí)間：人為判定-濃度的標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)深藍(lán)色;S4-5有淡藍(lán)色;機(jī)器判定620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值達(dá)到0.6-0.65
10 樣本濃度過(guò)高或存在基質(zhì)效應(yīng)建議做不同稀釋倍數(shù)，確認(rèn)樣本合適的稀釋倍數(shù)。
11 酶標(biāo)儀濾光片設(shè)置有問(wèn)題或者波長(zhǎng)選擇不對(duì)確認(rèn)儀器設(shè)置及選擇正確的波長(zhǎng)檢測(cè)。
12 酶標(biāo)板不適合做ELISA不能使用細(xì)胞培養(yǎng)板，建議使用ELISA用高吸附力板子。
背景深，全部呈有色(通常的Elisa背景值OD<0.2)
1 洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標(biāo)記物殘留洗液準(zhǔn)確配制;充分洗滌，靜置15，拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染。
2 底物污染，未避光保存，出現(xiàn)顏色棄去底物，重新配置
3 樣品稀釋液污染棄去稀釋液，重新配置
4 吸頭重復(fù)使用，未洗凈或消毒不吸頭盡可能一次性使用
5 不正確的孵育時(shí)間，溫度(尤其是底物孵育的時(shí)間)為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。按照說(shuō)明書(shū)要求。
6 偶聯(lián)抗體濃度過(guò)高按照說(shuō)明書(shū)調(diào)整到合適的濃度
7 ELISA板子不正確的貯存酶標(biāo)板貯存于2-8 ℃;使用結(jié)合力低點(diǎn)的Elisa板8 沒(méi)有正確封閉在標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中加入動(dòng)物蛋白或延長(zhǎng)封閉時(shí)間
9 樣本溶血嚴(yán)重建議使用非溶血或輕微溶血樣本，嚴(yán)重溶血樣本會(huì)導(dǎo)致背景偏高。
重復(fù)性不佳，高CV值
1 樣品不均一加樣充分混勻樣品，取樣確保移液位置一致;
2 包被板表面遭到破壞洗板加樣時(shí)盡量小心，避免破壞板的包被表面
3 孔與孔之間的交叉污染孵育后取下蓋子小心操作，避免孔與孔的污染;封板膜不能重復(fù)使用
4 加樣量不一致樣品稀釋?xiě)?yīng)充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴
5 邊緣效應(yīng)(外周孔顯色較中心孔深)孵育時(shí)盡量100 rpm旋轉(zhuǎn)混勻
6 微量加樣不準(zhǔn)確微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性
7 不正確的洗滌洗液準(zhǔn)確配制;充分洗滌，靜置15，確定每一步的洗滌出現(xiàn)白板
陽(yáng)性對(duì)照不顯色
1 顯色液變質(zhì)更換新的顯色液
2 洗滌液配制有誤請(qǐng)按說(shuō)明書(shū)所示稀釋倍數(shù)配制3 未加酶結(jié)合物而認(rèn)為已加入注意不要漏加
4 終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜镆菏褂妹看渭右壕鶓?yīng)看清標(biāo)簽
5 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法錯(cuò)誤/或標(biāo)準(zhǔn)品有問(wèn)題請(qǐng)按照說(shuō)明書(shū)所示配置說(shuō)明書(shū)，注意單位和稀釋倍數(shù)
6 不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑混用建議使用同批次試劑盒。不能混用不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑。
不正常的標(biāo)準(zhǔn)曲線
1 錯(cuò)誤的方法重懸標(biāo)準(zhǔn)品 加入正確量的溶液重懸標(biāo)準(zhǔn)品，重懸充分
2 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋錯(cuò)誤 按照說(shuō)明書(shū)要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品
3 標(biāo)準(zhǔn)品污染 使用一次性的滅菌吸頭，標(biāo)準(zhǔn)品貯存于2-8 ℃
4 錯(cuò)誤的倍比稀釋步驟 按照說(shuō)明書(shū)倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品
5 波長(zhǎng)選擇錯(cuò)誤TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而 者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm。雙波長(zhǎng)比色分析優(yōu)于單波長(zhǎng)。
6 標(biāo)準(zhǔn)品混用 不同批號(hào)試劑勿混用
7 試劑盒在運(yùn)輸途中時(shí)間太長(zhǎng)，溫度太高，標(biāo)準(zhǔn)品失活 盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間，夏季應(yīng)放冰塊降溫
8 ELISA未終止而直接檢測(cè)450nm和620nmTMB顯色需終止后檢測(cè)，否則會(huì)出現(xiàn)620nm比450nm讀數(shù)高的現(xiàn)象。
樣品或標(biāo)準(zhǔn)品OD超出正常范圍
1 錯(cuò)誤的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋 按照說(shuō)明書(shū)稀釋2 偶聯(lián)抗體濃度過(guò)高 按照說(shuō)明書(shū)調(diào)整到合適的濃度3 TMB底物孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 調(diào)整到合適的孵育時(shí)間4 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品污染 避免污染5 錯(cuò)誤的孵育時(shí)間或溫度 按照說(shuō)明書(shū)6 孵育時(shí)未加蓋導(dǎo)致溶液揮發(fā)和污染 貼封片或加蓋標(biāo)曲很好，但是樣本無(wú)法計(jì)算到數(shù)值1 標(biāo)曲選擇不合適選擇合適的標(biāo)曲擬合;
2 樣本含量很低，低于靈敏度無(wú)法被檢測(cè)到嘗試濃縮樣本或使用高敏ELISA試劑盒檢測(cè)3樣本含量很高，超過(guò)標(biāo)曲建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索稀釋倍數(shù)，確保樣本OD值落在標(biāo)曲范圍內(nèi)標(biāo)曲高濃度間無(wú)明顯趨勢(shì)1如OD絕對(duì)值靠譜，但是僅無(wú)梯度，則顯色過(guò)度TMB顯色體系中建議根據(jù)S1，S2顏色進(jìn)行判斷，當(dāng)S1，S2深藍(lán)色，有明顯梯度，S5有淡藍(lán)色時(shí)即可終止。
注：此產(chǎn)品供科研使用，以上資料供參考!
本生ELISA檢測(cè)試劑盒 天津 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過(guò)硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來(lái)維護(hù)和拓展市場(chǎng)，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠(chéng)合作，共創(chuàng)美好的未來(lái)。
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