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ELISA雙抗體夾心法有哪些常見問題?
以下是ELISA雙抗體夾心法實(shí)驗(yàn)中常見問題的系統(tǒng)分析及解決方案，本生技術(shù)小編結(jié)合多來源信息整理：
一、樣本相關(guān)異常?
假陽性/高背景?
原因?：血液溶血或纖維蛋白未清除，血紅蛋白干擾顯色?
對(duì)策?：3000rpm離心15min，取上清檢測，避免溶血樣本?
稀釋線性異常?
現(xiàn)象?：樣本孔OD值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍(>2.0或<0.1)?
調(diào)整?：按10倍梯度稀釋重測，確保OD值在0.1-1.5區(qū)間?
二、操作技術(shù)問題?
洗滌不充分?
表現(xiàn)?：整板均勻顯色(花板)或復(fù)孔CV>20%?
優(yōu)化?：洗板5次，每次拍板后更換吸水紙，避免交叉污染?
孵育條件失控?
溫度?：超過37℃導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加(建議恒溫箱校準(zhǔn))?
時(shí)間?：超過說明書建議時(shí)間(通常抗原孵育≤1小時(shí))?
三、試劑與設(shè)備問題?
抗體配對(duì)不當(dāng)?
影響?：鉤狀效應(yīng)(高濃度樣本假陰性)?
驗(yàn)證?：通過棋盤滴定確定最佳抗體濃度比?
底物失效?
判斷?：陽性對(duì)照孔顯色淺或無色?
處理?：現(xiàn)配現(xiàn)用TMB，避光保存，避免金屬離子污染?
四、數(shù)據(jù)分析異常?
標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合不佳?
指標(biāo)?：R2<0.99或低濃度點(diǎn)偏離?
措施?：檢查標(biāo)準(zhǔn)品溶解是否充分，復(fù)孔重復(fù)性?
靈敏度不足?
標(biāo)準(zhǔn)?：最高濃度孔OD值應(yīng)>1.0?
提升?：延長封閉時(shí)間(2小時(shí))或更換高親和力抗體?
注：以上資料僅供參考，如需進(jìn)一步了解產(chǎn)品詳情，可參考品牌供應(yīng)商或技術(shù)老師。
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